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食品安全问题

霉变谷物中毒

黄曲霉毒素B1(AFB1)酶联免疫定量检测试剂盒使用说明
方法编号:CDC-5511

  本测试盒用间接竞争免疫分析法定量测定谷物中AFB1。该 测试盒反应孔可拆卸,可测单份样品,也可测多份样品。定量分析时需有 含450nm波长的微孔板酶标仪。

1 概要
  黄曲霉毒素是由曲霉菌属的黄曲霉和寄生曲霉等产生的次 级代谢产物,主要污染玉米、花生、坚果等。天然污染的黄曲霉毒素以AFB1 为主,AFB1属于强烈致癌物质,肝脏是其主要的靶器官, 具有极强的急性毒性和致癌性。
  AFB1检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法 (HPLC)和ELISA方法,本试剂盒是以应用单克隆抗体为基础的ELISA检测方 法,可以准确快速检测粮谷类和花生及饲料中的AFB1

2 测定原理
  本试剂盒采用固相酶联免疫吸附原理,利用间接竞争ELISA 法进行测定。用抗原包被微孔板,加入AFB1标准品或样品、抗AFB1单克隆 抗体进行孵育后,将未与包被抗原结合的抗体洗去;再加入酶标记的抗鼠 IgG抗体孵育,加入显色液,经过终止液终止后, 用酶标仪在450nm处测定OD值。

3 提供的物品
----微孔板…………………………………………………………… 包被有AFB1-BSA
----5个浓度的AFB1标准溶液(各0.5mL)

标准1:0ng/mL…………………………………………………………….直接使用
标准2:0.1ng/m…………………………………………………………….直接使用
标准3:0.2ng/mL ………………………………………………………….直接使用
标准4:0.5ng/m………………………………………………….…………直接使用
标准5:1.0ng/m………………………………………….…………………直接使用

----抗AF B1单克隆抗体溶液(6mL)……………………………………………直接使用
----酶标物(12mL)..………………………………………………………………直接使用
----显色液(12mL)..………………………………………………………………直接使用
----终止液(6mL)…………………………………………………………………直接使用
----浓缩洗液(30mL)..……………………………………………………………稀释使用

4 盒中未提供,需自备物品
----微孔板酶标仪(可于450nm处测定)、振荡器、粉碎机、微量移液器
----量筒、漏斗、容量瓶、快速定性滤纸
----氯化钠(分析纯)、甲醇(分析纯)、去离子水或蒸馏水

5 操作者注意事项
----标准溶液中含有黄曲霉毒素,应特别小心。
----使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素溶液最好用pH7的次氯酸溶液 (10%v/v)浸泡过夜。
----终止液含有硫酸,避免接触皮肤。
----每次加样后立即将所有试剂放回2~8 ℃。
----每步加样时间应控制在5min内。
----孵育过程中应避光。
----不要使用过期试剂盒。
----不要交叉使用不同批号的试剂盒中的试剂。

6 储存条件
----保存试剂盒于2~8℃。不要冷冻.
----显色液对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下。
----将不用的微孔板放进原铝箔袋中,置2~8℃保存。

7 试剂变质的标志
----标准1的吸光度值小于0.5个单位(A450nm<0.5)时, 表示试剂可能变质。

8 样品处理
----样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存。
----取5g粉碎的有代表性的样品, 加1.25g氯化钠及25mL70%甲醇-水溶液。
----强力振荡3分钟。
----用快速定性滤纸过滤。
----取1mL滤液,加水4mL进行稀释。
----取50μL稀释液进行分析。
----*根据需要可以增减样品量,但甲醇-水溶液的量也应相应增减。

9 酶免疫分析程序
----浓缩洗液为10倍浓缩液, 使用时与去离子水或蒸馏水按体积比1:9稀释后使用。
----取所需数量的板条插入微孔架,用洗液洗涤微孔板3min×2次。
----加入50mL标准品或处理好的样品到微孔,记录样品及标准的位 置,每个标准和样品必须使用新的吸头。
----加入50mL抗体溶液到每个微孔(注意移液器管尖不要接触到孔 中的液体,避免交叉污染)中,37℃孵育90min。
----甩掉孔中液体,用洗液洗涤微孔板3min×3次,最后一次应在吸 水纸上拍打以完全除去孔中液体。
----每孔加入酶标物100mL,37℃孵育60min。
----用洗液洗涤微孔板3min×5次,最后一次应在吸水纸上拍打 以完全除去孔中液体。
----每孔加入显色液100mL(2滴),37℃孵育10~12min。
----每孔加入终止液50mL(1滴),立即用酶标仪在波长450nm 处测定吸光度值(OD值)。
注:在定量分析中,显色液和终止液需要用移液器准确量取。

10 样品浓度计算
  以标准溶液OD值与标准1OD值的比值为纵坐标,所对应 标准溶液浓度(ng/mL)的对数值为横坐标,制作标准曲线。根据样品 OD值与标准1OD的比值,可从曲线上得到对应点的横坐标,即为AFB1浓 度的对数值,求得反对数即为测定液中AFB1浓度C(ng/mL),按下列公 式计算出样品中AFB1含量: AFB1含量(mg/kg)= C×K
式中:C:稀释后样品提取液中AFB1含量(ng/mL)
K:样品稀释倍数(按照本说明书中样品处理程序方法为25)

11试剂盒主要技术指标及参数
  测试盒最低检出浓度0.1ng/mL,回收率70%~120%,与 AFB2的交叉反应系数小于1%,与AFG1的交叉反应系数为4.65%, 与AFG1交叉反应系数小于1%。试剂盒校正曲线的线性范围 0.1~1.0ng/mL,试剂盒条内变异<10%,条间变异<15%。

附图 (仅供参考)

AFB1毒素浓度对数(ng/mL)

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